以 PerkinElemer FL 6500 和 Matlab 的 drEEM 工具箱为例
1. 数据
1.1 所需数据
1.1.1 样品的三维荧光数据
对于样本的三维荧光扫描（Excitation, Emission, Intensity）。大家根据自己想分析的物质自行决定。
1.1.2 样本的紫外分光扫描
当进行荧光测量时，样品可能会吸收部分激发光和发射光，导致荧光信号的减弱，这种现象被称为内滤效应（Inner Filter Effect，IFE）。内滤效应会影响荧光强度的准确性，导致定量分析出现误差。
为了校正内滤效应，需要获取样品在不同波长下的吸光度数据。对于样本的紫外分光扫描，应以 1～2 mm 的步进覆盖整个三维荧光扫描的区域，如果能向外延展则更好。例如，三维荧光的区域是 Ex = 200:0.1:500 nm 和 Em = 370:10:570 nm ，紫外分光的区域则推荐到 190:1:580 nm。
1.1.3 空白样品的三维荧光数据
建议使用与被测样品相同的溶剂进行扫描，一般为普通的 DI 或者 Milli-Q® 水。扫描区域建议与被测样品的区域相同甚至更大一些。
1.1.4 仪器校正因子
博主也还没搞清楚喵 :[
好像是用到硫酸奎宁？
“具体来说，硫酸奎宁是一种常用的荧光标准物质，其荧光量子产率已知且稳定。在荧光光谱分析中，使用硫酸奎宁的发射扫描可以校准仪器的响应，确保荧光测量的准确性和可比性。”
大概也是用于仪器校准用吧……？
最后，博主决定使用仪器自带的矫正数据。
1.1.5 拉曼标准化扫描
以下均采用普通的 DI 或者 Milli-Q® 水作为扫描对象。
1.1.5.1 方法一 (Method 1):
- 使用激发波长为 275 nm 的拉曼扫描。
- 选择 Em = 290:1:320 nm 作为积分范围。
1.1.5.2 方法二 (Method 2):
- 使用激发波长为 350 nm 的拉曼扫描。
- 选择 Em = 374:1:426 nm 作为积分范围。
1.2 数据处理
1.2.1 拉曼峰
1.2.1.1 一级拉曼
首先，应先检查EEM图像，确认峰的位置。
eemreview(subdataset(DS,[],DS.Em>580,DS.Ex<250))2. FRI 分析
原理
区域体积积分公式（离散形式）：
区域体积积分公式（连续形式）：$$\Phi_i = \int_{\text{ex}} \int_{\text{em}} I(\lambda_{\text{ex}}, \lambda_{\text{em}}) d\lambda_{\text{ex}} d\lambda_{\text{em}}$$
其中：
- $$\Phi_i$$ 是第 $i$ 个区域的体积
- $$I(\lambda_{\text{ex}}, \lambda_{\text{em}})$$ 是在给定激发和发射波长下的荧光强度
- $$\Delta\lambda_{\text{ex}}$$ 是激发波长间隔
- $$\Delta\lambda_{\text{em}}$$ 是发射波长间隔
- 归一化区域体积公式：
$$\Phi_{i,n} = \text{MF}_i \Phi_i$$
其中 $\text{MF}_i$ 是每个区域的乘法因子，用于校正区域面积。
- 总归一化体积计算：
$$\Phi_{T,n} = \sum_{i=1}^{5} \Phi_{i,n}$$ - 百分比荧光响应计算：
$$P_{i,n} = \frac{\Phi_{i,n}}{\Phi_{T,n}} \times 100\%$$
此外，FRI 将整个图形划分为五个区域，他们分别是：
- 芳香族蛋白质
- 类酪氨酸物质
- 类富里酸物质
- 可溶性微生物产物
- 类腐殖酸物质